Zakres książki obejmuje kurs podstawowy biochemii oraz kursy specjalistyczne i magisterskie. Może też służyć początkującym pracownikom naukowym.

W podręczniku omówiono wszystkie ważne metody i techniki stosowane w badaniach biochemicznych i laboratoriach, dotyczące głównych grup związków występujących w materiale organicznym oraz analizę płynów ustrojowych, a także wyodrębnienie struktur subkomórkowych. Pozycja zawiera także dane teoretyczne potrzebne do zrozumienia zasad wykonywanych eksperymentów.

Grupy ćwiczeń poprzedzono zwięzłymi wprowadzeniami dotyczącymi metodyki badań – od sporządzania roztworów i obliczeń statystycznych po DODATEK, zawierający tabele statystyczne i przepisy sporządzania buforów.

Książka jest przeznaczona dla studentów biologii uniwersytetów, akademii medycznych, rolniczych oraz biotechnologii i ochrony środowiska. Treść oparto na najnowszej wiedzy biochemicznej i dostosowano do programów nauczania tychże uczelni.

Rozdziały:

CZĘŚĆ I. WIADOMOŚCI PODSTAWOWE 23

1. Roztwory (A. Zgirski) 28
1.1. Stężenia roztworów 28
1.1.1. Roztwory procentowe 28
1.1.2. Roztwory molowe 31
1.1.3. Roztwory wzorcowe (standardowe) 36
1.2. Roztwory buforowe 36
1.2.1. Wykładnik wodorowy pH 36
1.2.2. Siła jonowa 37
1.2.3. Siła jonowa buforów i ich pH 38

2. Statystyczna ocena wyników (A. Zgirski) 40
2.1. Szereg prosty i rozdzielczy 40
2.2. Wartości średnie 41
2.2.1. Średnia arytmetyczna 41
2.2.2. Średnia arytmetyczna ważona 42
2.2.3. Średnia geometryczna 42
2.3. Wskaźniki rozproszenia 44
2.3.1. Wariancja i odchylenie standardowe 44
2.3.2. Odchylenie standardowe średniej arytmetycznej 46
2.3.3. Odchylenie standardowe grup połączonych 46
2.3.4. Współczynnik zmienności (wskaźnik Pearsona) – odchylenie względne 47
2.4. Odrzucanie wyników niepewnych (wątpliwych) 48
2.5. Wnioskowanie statystyczne 52
2.5.1. Rozkład normalny 52
2.5.2. Rozkład t 53
2.5.3. Test dwustronny i jednostronny 53
2.5.4. Test istotności t Studenta dla prób niezależnych. Ocena istotności (nieprzypadkowości) różnic między dwiema średnimi 55
2.5.5. Test istotności t Studenta dla prób zależnych (test sparowany) 57
2.5.6. Test C Cochrana i Coxa 58
2.5.7. Porównanie jednorodności wariancji dwóch szeregów statystycznych. Test Fishera-Snedecora 60
2.5.8. Przedział ufności 61
2.6. Współzależności zmiennych 62
2.6.1. Związek korelacyjny. Współczynnik korelacji 62
2.6.2. Wyznaczanie prostej regresji metodą najmniejszych kwadratów 64
2.7. Test zgodności χ2 70

CZĘŚĆ II. NIEKTÓRE METODY FIZYKOCHEMICZNE 73

3. Kolorymetria (A. Zgirski) 74
3.1. Teoretyczne podstawy kolorymetrii 74
3.2. Sposoby obliczania stężeń z odczytanej absorbancji 80
3.2.1. Sposoby obliczania stężeń po wywoływaniu zabarwienia dla jednakowych objętości próby badanej i wzorcowej 80
3.2.2. Sposoby obliczania stężeń po wywoływaniu zabarwienia dla niejednakowych objętości próby badanej i wzorcowej 82
3.2.3. Sposoby obliczania stężeń a stosowanie się roztworów do prawa Lamberta-Beera 88

4. Chromatografia 91
4.1. Wiadomości podstawowe (L. Kłyszejko-Stefanowicz) 92
4.1.1. Niektóre terminy stosowane w chromatografii 92
4.1.2. Rodzaje chromatografii 93
4.1.3. Metody stosowane w chromatografii 94
4.1.4. Śledzenie przebiegu procesu chromatograficznego 95
4.2. Chromatografia adsorpcyjna (L. Kłyszejko-Stefanowicz) 97
4.2.1. Adsorbenty i rozpuszczalniki 98
4.2.2. Czynniki wpływające na powinowactwo adsorpcyjne 100
4.3. Chromatografia jonowymienna (L. Kłyszejko-Stefanowicz, A. Lipińska) 103
4.3.1. Charakterystyka procesu wymiany jonów 103
4.3.2. Klasyfikacja jonitów 106
4.4. Chromatografia podziałowa (L. Kłyszejko-Stefanowicz, A. Lipińska) 112
4.4.1. Ogólna charakterystyka chromatografii podziałowej 112
4.4.2. Chromatografia podziałowa kolumnowa 114
4.4.3. Chromatografia podziałowa bibułowa 114
4.4.4. Przykłady metod jakościowej oraz ilościowej analizy aminokwasów metodą chromatografii podziałowej bibułowej 122
4.5. Chromatografia cienkowarstwowa 125
4.5.1. Podstawy teoretyczne (E. Majkowska) 125
4.5.2. Technika (E. Majkowska) 126
4.5.3. Przegląd technik chromatografii cienkowarstwowej (E. Majkowska) 131
4.5.4. Chromatografia cienkowarstwowa produktów hydrolizy glutationu oraz niektórych jednocukrów
4.5.5. Chromatografia cienkowarstwowa alkaloidów glistnika jaskółczego ziela – Chelidonium majus
4.6. Filtracja żelowa (M.T. Schmidt) 137
4.6.1. Niektóre sita molekularne 137
4.6.2. Teoria filtracji żelowej 141
4.6.3. Technika pracy na żelach Sephadex 144
4.7. Chromatografia powinowactwa (Cz.S. Cierniewski, B. Walkowiak) 147
4.7.1. Podstawy teoretyczne 147
4.7.2. Złoża stosowane w chromatografii powinowactwa 149
4.7.3. Chromatografia kowalencyjna jako szczególny przypadek chromatografii powinowactwa 164
4.7.4. Chromatografia chelatująca jako szczególny przypadek chromatografii powinowactwa 165
4.8. Chromatografia wykorzystująca hydrofobowe właściwości cząsteczek (Cz.S. Cierniewski, B. Walkowiak) 166
4.8.1. Podstawy teoretyczne chromatografii oddziaływań hydrofobowych 167
4.8.2. Złoża stosowane w chromatografii oddziaływań hydrofobowych 169
4.8.3. Podstawy teoretyczne chromatografii fazy odwróconej 172
4.8.4. Złoża stosowane w chromatografii fazy odwróconej 174

5. Elektroforeza w nośnikach 181
5.1. Elektroforeza bibułowa (A. Zgirski) 182
5.1.1. Wiadomości podstawowe (A. Zgirski) 182
5.1.2. Elektroforeza bibułowa białek surowicy (A. Zgirski) 184
5.1.3. Elektrochromatograficzny rozdział aminokwasów (R. Wierzbicki) 189
5.2. Analiza elektroforetyczna białek w żelu poliakrylamidowym 191
5.2.1. Wiadomości podstawowe (Z.M. Kiliańska) 191
5.2.2. Jednowymiarowa elektroforeza histonów w żelu poliakrylamidowym (A. Lipińska) 198
5.2.3. Jednowymiarowa elektroforeza białek niehistonowych w żelu poliakrylamidowym
5.3. Dwuwymiarowa elektroforeza białek (Z.M. Kiliańska) 207
5.4. Analiza białek techniką Western blotting 211
5.4.1. Wiadomości podstawowe (W.M. Krajewska) 211
5.4.2. Immunoidentyfikacja w obecności PAP i AP (W.M. Krajewska i Z.M. Kiliańska) 216
5.4.3. Immunoidentyfikacja glikoprotein (A. Lipińska) 220
5.5. Kompleksowa jakościowa i ilościowa analiza jedno- i dwuwymiarowych elektroferogramów (M. Bryś) 224

CZĘŚĆ III. ANALIZA PODSTAWOWYCH SKŁADNIKÓW USTROJOWYCH 231

6. Białka 232
6.1. Właściwości białek i aminokwasów (R. Wierzbicki) 233
6.1.1. Amfoteryczność białek 233
6.1.2. Białka jako koloidy 238
6.1.3. Rozpuszczalność i wysalanie białek 239
6.1.4. Denaturacja białek 242
6.2. Odczyny barwne na aminokwasy i białka (R. Wierzbicki) 245
6.3. Oznaczanie zawartości aminokwasów i białek (A. Lipińska, R. Wierzbicki) 246
6.4. Oznaczanie N-końcowego aminokwasu (A. Lipińska, R. Wierzbicki) 251
6.5. Oznaczanie C-końcowego aminokwasu (A. Lipińska) 257

7. Cukry i proteoglikany 260
7.1. Jednocukry (monosacharydy) (A. Zgirski) 260
7.1.1. Właściwości fizyczne jednocukrów 260
7.1.2. Właściwości chemiczne jednocukrów 266
7.1.3. Oznaczanie ilościowe jednocukrów 275
7.2. Dwucukry (A. Zgirski) 276
7.3. Wielocukry 280
7.3.1. Homoglikany (A. Zgirski) 280
7.3.2. Glikozaminoglikuronoglikany (kwaśne mukopolisacharydy) (M.T. Schmidt) 283
7.4. Identyfikacja cukrów (H. Łukasiak) 292
7.5. Proteoglikany – struktura chemiczna i właściwości (M.T. Schmidt) 295

8. Lipidy i lipoproteiny 306
8.1. Lipidy (R. Wierzbicki) 306
8.1.1. Podstawowe właściwości fizykochemiczne lipidów 308
8.1.2. Oznaczanie zawartości lipidów w materiale biologicznym 312
8.1.3. Wyodrębnianie i analiza lipidów złożonych 316
8.2. Lipoproteiny i enzymy związane z przemianami lipoprotein (Z.M. Kiliańska) 320
8.2.1. Materiał i metody oznaczania składników lipidowo-białkowych surowicy krwi 324

9. Nukleoproteiny i oznaczanie zawartości kwasów nukleinowych 332
9.1. Nukleoproteiny (L. Kłyszejko-Stefanowicz, A. Lipińska) 332
9.1.1. Niektóre właściwości nukleoprotein 333
9.1.2. Białka związane z RNA 335
9.1.3. Białka związane z DNA 336
9.1.4. Izolowanie RNP 339
9.1.5. Izolowanie DNP i jego komponentów 341
9.1.6. Ogólna analiza preparatów RNP i DNP 345
9.2. Metody oznaczania zawartości kwasów nukleinowych (Z. Walter) 347
9.2.1. Metoda Schmidta i Thannhausera 348
9.2.2. Metoda Schneidera 350
9.2.3. Metoda Ogura i Rosen 350
9.2.4. Spektrofotometryczna metoda oznaczania kwasów nukleinowych według Tsaneva i Markova 351

10. Kwasy nukleinowe 360
10.1. Otrzymywanie preparatów kwasów nukleinowych i ogólne zasady ich izolowania (J. Błasiak) 366
10.1.1. Standardowe metody izolowania DNA 369
10.1.2. Izolowanie wysokocząsteczkowego i niskocząsteczkowego DNA 379
10.1.3. Izolowanie RNA 382
10.1.4. Jednoczesne izolowanie RNA i DNA 386
10.2. Badanie właściwości kwasów nukleinowych 389
10.2.1. Niektóre właściwości fizyczne i chemiczne kwasów nukleinowych (J.K. Bartkowiak,
10.2.2. Spektrofotometria kwasów nukleinowych (J.K. Bartkowiak, R. Wierzbicki) 393
10.2.3. Denaturacja DNA (I. Kulamowicz, R. Oliński) 398
10.2.4. Badanie stopnia spolimeryzowania DNA metodą wiskozymetryczną (R. Oliński,
10.2.5. Badanie niejednorodności preparatów DNA (R. Oliński, I. Kulamowicz) 406
10.2.6. Oscylopolarograficzne i pulsopolarograficzne badanie preparatów DNA (Z. Walter) 407
10.2.7. Analiza składu nukleotydowego (R. Wierzbicki) 415
10.2.8. Oznaczanie składu nukleozydowego techniką HPLC (K. Białkowski, R. Oliński) 420
10.3. Analiza ilościowa i strukturalna kwasów nukleinowych 431
10.3.1. Analiza ilościowa kwasów nukleinowych (J. Błasiak) 431
10.3.2. Zastosowanie enzymów restrykcyjnych w analizie DNA (J. Błasiak) 435
10.3.3. Elektroforetyczna analiza kwasów nukleinowych w żelu agarozowym i poliakrylamidowym
10.3.4. Analiza kwasów nukleinowych przez hybrydyzację (J.K. Bartkowiak) 452
10.3.5. Analiza kwasów nukleinowych techniką PCR (J.K. Bartkowiak) 463

11. Enzymy 471
11.1. Ogólne właściwości enzymów (A. Zgirski) 471
11.2. Izolowanie i oznaczanie enzymów (A. Zgirski) 475
11.2.1. Izolowanie enzymów 475
11.2.2. Oznaczanie aktywności enzymów 476
11.2.3. Rola oznaczania enzymów w diagnostyce klinicznej 480
11.3. Kinetyka reakcji enzymatycznych (A. Zgirski) 483
11.3.1. Stała i rząd reakcji 483
11.3.2. Stała Michaelisa 489
11.3.3. Czynniki wpływające na szybkość reakcji enzymatycznych 496
11.3.4. Wykreślanie danych kinetyki enzymatycznej i wyznaczanie typów inhibicji 503
11.4. Badania jakościowe niektórych enzymów (A. Zgirski) 520
11.4.1. Oksydoreduktazy (klasa 1) 520
11.4.2. Hydrolazy (klasa 3) 523
11.5. Metody oznaczania niektórych enzymów 529
11.5.1. Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) (A. Zgirski) 529
11.5.2. Ceruloplazmina (Cp) (A. Zgirski) 531
11.5.3. Peroksydazy roślinne (H. Urbanek) 541
11.5.4. Rybonukleazy (RNazy) (Z. Walter) 544
11.5.5. Aminotransferazy: asparaginianowa (AST) i alaninowa (ALT) (A. Zgirski) 549
11.5.6. Acetylocholinoesteraza (AChE) i cholinoesteraza (ChE) (A. Zgirski) 554
11.5.7. Hydrolazy monoestrów fosforanowych (fosfatazy zasadowe i kwasowe (A. Zgirski) 556
11.5.8. Proteinazy chromatynowe (A. Lipińska) 560
11.5.9. Amylazy (H. Urbanek, A. Zgirski) 562
11.5.10. Amoniako-liazy (H. Urbanek) 564
11.6. Cytochrom c (E. Łoza) 566
11.7. Chlorofil (H. Urbanek) 571

CZĘŚĆ IV. ANALIZA PŁYNÓW USTROJOWYCH 575

12. Krew 576
12.1. Właściwości ogólne krwi (A. Zgirski, M. Hilewicz-Grabska) 576
12.1.1. Skład krwi 576
12.1.2. Ciśnienie osmotyczne i hemoliza krwi 576
12.1.3. Pobieranie i odbiałczanie krwi 580
12.1.4. Wykrywanie niektórych składników surowicy 581
12.2. Białka krwi (A. Zgirski, M. Hilewicz-Grabska) 582
12.2.1. Hemoglobina – białko erytrocytów 582
12.2.2. Białka surowicy krwi 588
12.2.3. Glikoproteiny (B. Wachowicz) 590
12.3. Niebiałkowe składniki organiczne (A. Zgirski, M. Hilewicz-Grabska) 592
12.3.1. Mocznik 592
12.3.2. Kwas moczowy 596
12.3.3. Kreatyna i kreatynina 598
12.3.4. Bilirubina 599
12.3.5. Glukoza 603
12.4. Składniki nieorganiczne krwi (A. Zgirski, M. Hilewicz-Grabska) 606
12.4.1. Wiadomości ogólne 606
12.4.2. Wapń 607
12.4.3. Żelazo 609
12.4.4. Miedź 612
12.4.5. Chlorki 615
12.4.6. Fosfor 618
12.5. Krzepnięcie krwi (T. Krajewski, P. Nowak) 623
12.5.1. Hemostaza ogólna 623
12.5.2. Fibrynogen, struktura, właściwości fizykochemiczne i biologiczne 626
12.5.3. Mechanizm krzepnięcia krwi 629
12.5.4. Fibryno(geno)liza 639
12.5.5. Metody izolowania fibryny(ogenu) oraz badanie ich właściwości fizykochemicznych i biologicznych 645
12.5.6. Ogólne badanie krzepnięcia krwi 652
12.5.7. Oznaczanie niektórych czynników układu krzepnięcia i fibrynolizy 656
12.6. Płytki krwi, ich aktywacja i udział w hemostazie 665
12.6.1. Charakterystyka płytek krwi (B. Olas) 665
12.6.2. Aktywacja płytek krwi (B. Wachowicz) 671
12.6.3. Udział płytek krwi w hemostazie (B. Wachowicz) 683

13. Mocz (A. Zgirski) 695
13.1. Powstawanie moczu 695
13.2. Skład chemiczny moczu 698
13.3. Badanie właściwości fizycznych moczu 700
13.4. Badanie chemiczne moczu prawidłowego 702
13.5. Badanie chemiczne moczu patologicznego 707
13.5.1. Białko 707
13.5.2. Cukier 708
13.5.3. Związki ketonowe 709
13.5.4. Krew 711
13.5.5. Barwniki żółciowe 711

14. Soki trawienne (A. Zgirski) 713
14.1. Trawienie i wchłanianie 713
14.2. Ślina 715
14.2.1. Skład śliny 715
14.2.2. Badanie śliny 716
14.3. Sok żołądkowy 717
14.3.1. Skład soku żołądkowego 717
14.3.2. Badanie soku żołądkowego 719
14.4. Sok trzustkowy 724
14.4.1. Skład soku trzustkowego 724
14.4.2. Badanie soku trzustkowego 726
14.5. Sok jelitowy 728
14.5.1. Skład soku jelitowego 728
14.5.2. Badanie soku jelitowego 729
14.6. Żółć 730
14.6.1. Skład i znaczenie żółci 730
14.6.2. Badanie żółci 732

CZĘŚĆ V. IZOLOWANIE I ANALIZA NIEKTÓRYCH STRUKTUR KOMÓRKOWYCH 733

15. Frakcjonowanie morfologiczne komórki 734
15.1. Zarys ultrastruktury i frakcjonowanie komórki (L. Kłyszejko-Stefanowicz) 734
15.2. Przykładowe izolowanie podstruktur komórkowych z nukleoplastu i cytoplastu 740
15.2.1. Otrzymywanie jąderek (A. Lipińska) 740
15.2.2. Otrzymywanie błon aparatu Golgiego (M. Hilewicz-Grabska) 742

16. Jądro komórkowe 746
16.1. Izolowanie jąder komórkowych (Z.M. Kiliańska) 746
16.2. Hydrolaza glukozo-6-fosforanowa (EC 3.1.3.9) – enzym znacznikowy siateczki śródplazmatycznej
16.3. Chromatyna (A. Lipińska) 753
16.4. Frakcjonowanie jąder komórkowych 756
16.4.1. Enzymatyczne frakcjonowanie jąder komórkowych (W.M. Krajewska) 756
16.4.2. Frakcjonowanie jąder komórkowych z wydzieleniem matriks jądrowej (Z.M. Kiliańska) 759

17. Mitochondria (Z.M. Kiliańska) 765

18. Różnicowanie komórkowe na przykładzie czerwonych krwinek ptaków i ssaków (W.M. Krajewska) 768

19. Dodatek (R. Wierzbicki, A. Zgirski) 775